A.
Pendahuluan
Bioteknologi
adalah salah satu cabang ilmu yang melibatkan teknologi untuk meneliti organisme-organisme.
Salah satu manfaat dari bioteknologi ini diterapkan pada alat elektroforesis,
dimana elektroforesis merupakan suatu alat yang berfungsi untuk memisahkan
makromolekul yang memiliki muatan seperti protein, DNA atau RNA dengan
menggunakan energi listrik.
Setiap
molekul bermuatan memiliki ukuran dan bentuk yang berbeda-beda. Untuk
mengetahui perubahan-perubahan molekul bermua-tan
tersebut dapat dilakukan teknik elektroforesis, yaitu teknik pemisahan komponen
atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya (bentuk, ukuran
dan muatan) dalam medan listrik. Elektroforesis sangat bermanfaat untuk memisahkan protein
berdasarkan muatannya, selain itu elektroforesis dapat dimanfaatkan sebagai
alat bantu diagnosa penyakit.
Dimana prinsip kerja elektroforesis itu dimulai
pada saat makromolekul ditempatkan pada medium bermuatan listrik. Molekul yang
bermuatan positif (+) akan bergerak ke kutub negatif (-) sedangkan molekul yang
bermuatan (-) akan bergerak ke kutub (+).
Percobaan ini
menggunakan teknik elektroforesis dengan media agarosa. Dengan membuat
origin (sumuran) pada agarosa yang diletakkan pada kutub (+) atau (-) sesuai
dengan muatan molekul yang akan diperiksa.
Kelebihan menggunakan agarosa adalah:
1.
Mudah didapat dan dibuat
2. Preparasi
gel lebih cepat dilakukan karena pembuatan gel agarosa lebih mudah dan bersifat
non toksik
3.
Laju pemisahan lebih cepat sehingga
fragmen DNA pun lebih cepat terbentuk
4. Dapat
memisahan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya
5.
Dapat dilakukan pada suhu kamar.
Namun kekurangan dari medium agarosa
ini yaitu : mudah rusak karena
merupakan gel yang strukturnya kenyal.
B.
Percobaan
a)
Alat :
1. Elektroforesis chamber
2. Power supply
3. Mikropipet
b) Bahan :
·
Plasma
·
Agarosa
·
Buffer TAE 1x
·
Cooamassie R250 staining solution (0,1%
Coomassie Blue R250 (w/w), 30% metanol, 5% asam asetat)
·
Destain solution 1 (30% metanol, 5% asam
asetat)
·
Destain solution 2 (7% asam asetat, 5%
metanol)
c) Langkah Kerja
1.
Diletakkan agarosa yang telah dicetak
dalam chamber
2. Dimasukkan
buffer TAE 1x pada chamber jangan sampai melebihi jembatan
3.
tempat agarosa diletakkan
4. Dimasukkan
plasma kedalam sumur (origin) dengan berjarak 1 origin kosong dalam agarosa
dengan digunakan mikropipet ± 50 µL
5.
Dihubungkan kabel dengan power supply.
Set power supply :
·
Voltase 220 v
·
Arus 90 A
·
Waktu 60 menit
6. Dijalankan power supply
7. Setelah 60 menit, dimatikan power
supply dan ankat agarosa.
8. Dimasukkan
agarosa dalam larutan Coomassie R250 staining
solutin
dan diamkan selama 5 menit ( gunakan hand
gloves ), lalu angkat
agarosa dan masukan dalam Destain Solution
1 lalu diamkan selama
5 menit, kemudian angkat agarosa dan
masukan dan Destain
Solution 2 lalu diamkan selama 5 menit.
9. Diamati
dan Identifikasi hasil plasma protein tersebut.
C. Hasil Percobaan
Hasil akhir dari
percobaan ini memberikan hasil adanya perubahan yang terjadi pada agarosa .
Hasil elektroforesis didapatkan pita-pita atau garis-garis protein yang terpisahkan
berdasarkan bentuk, ukuran dan muatan molekulnya. Di bawah pengaruh medan
listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona
atau pita yang sama atau berdekatan. Sehingga menimbulkan jarak dengan molekul
yang berbeda. Hasil dari percobaan tersebut lebih baik dilihat dengan bantuan
sinar UV di ruang gelap, sehingga terlihat lebih jelas.
D. Pembahasan
1.
Pengertian
Elektroforesis
Elektroforesis berasal dari bahasa
Yunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikel-partikel
listrik. Metode elekroforesis telah digunakan dan dikembangkan untuk penelitian
di bidang biologi dan genetika, serta ilmu kedokteran.
Elektroforesis
merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik.
Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan,
bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk
separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Elektroforesis untuk
makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi
karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan.
2. Media Elektroforesis
Elektroforesis
biasanya memerlukan media sebagai tempat ber-migrasinya molekul. Medianya
bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media
penyangga yang sering dipakai dalam elektroforesis antara lain yaitu kertas,
cellulose acetate, agar gel, starch gel, starch grain, dan gel
poliakrilamid. Gel poliakrilamid dan
agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein
dan asam nukleat, contoh lainnya adalah barbiturate buffer.
3. Faktor-faktor
yang Mempengaruhi Migrasi Molekul
Prinsip
elektroforesis adalah bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi
yang bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda negatif dan sebaliknya. Beberapa
faktor yang mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein
yakni:(Soedarmadji, 1996)
a.
Ukuran
molekul protein
Migrasi molekul
protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil.
b.
Konsentrasi
gel
Migrasi molekul
protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul yang
sama pada gel berkonsentrasi tinggi.
c.
Bufer
(penyangga)
Berperan sebagai
penstabil medium pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa
karena ion sebagai pembawa protein yang bermuatan.
a.
Kekuatan
ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik
menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein.
b.
Kekuatan
ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan
sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat.
d.
Medium
penyangga
Medium pendukung
ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif
stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi
elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel poliakrilamid.
e.
Kekuatan
voltase
Semakin tinggi
voltase maka aktivitas molekul meningkat.
f.
Temperatur
medium disaat proses elektroforesis berlangsung.
Jika temperature tinggi
akan mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperatur
rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein.
4. Molekul-molekul
Hasil Elektroforesis
a.
Albumin
Albumin terdapat
sekitar 55-64% dalam protein setiap 4-5 gm ml darah. Albumin merupakan molekul
terkecil dengan berat molekul 69.000-70.000 dalam protein. Sehingga dalam
percobaan elektroforesis, albumin merupakan molekul yang paling jauh
perpindahannya.
b.
Globulin
· Alpha Globulins (α-globulins)
Alpha globulins
mempunyai berat molekul 150.000-160.000 dan berfungsi mengikat lipid, thyroxin,
ceruloplasmin, dan cortisol. Dalam percobaan, alpha globulins ini terletak
setelah albumin, karena molekulnya lebih berat dibanding dengan albumin.
· Beta Globulins (β-globulins)
Beta
globulins mempunyai berat molekul 160.000-200.000 dan berperan dalam fungsi
utama protein plasma dan mengikat zat besi dan kolesterol. Dalam percobaan, beta
globulins ini terletak setelah alpha globulins, karena molekulnya lebih berat dibanding
dengan alpha globulins.
· Gamma Globulins (γ-globulins)
Gamma
globulins mempunyai berat molekul 150.000-900.000 dan berperan sebagai imun,
sehingga disebut juga immunoglobulins (Ig) atau antibody. Dalam percobaan, gamma
globulins ini terletak setelah beta
globulins, karena molekulnya lebih berat dibanding dengan beta globulins dan
merupakan molekul terberat, sehingga membuat gamma globulin mengalami
perpindahan yang paling dekat.
E. Kesimpulan dan Saran
1. Kesimpulan
Elektroforesis
merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik.
Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan,
bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk
separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Namun, untuk separasi
protein dan asam nukleat dibutuhkan penyangga seperti barbiturate buffer untuk
mencegah difusi akibat panas yang dihasilkan arus listrik. Bila berada dalam suatu
medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda
negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk
memisahkan molekulmolekul berdasarkan muatannya.
2. Saran
Saran pada praktikum kali ini adalah
sebaiknya praktikum dilakukan oleh praktikan sendiri dan dilakukan proses
elektroforesis yang sebenarnya sejak awal hingga didapatkan hasil yang nyata supaya
praktikan lebih mengetahui cara menggunakan metode elektroforesis.
DAFTAR PUSTAKA
Sudarmadji,
S. 1996. Teknik Analisa Biokimiawi,
edisi pertama. Yogyakarta: Liberty.
Muray,
K. Robert, et al., eds. 1999. a LANGE
medical book Harper’s Biochemistry, 25th ed. USA: Lange.
Klippel,
John H., et al., eds. 2008. Primer on the
Rheumatic Diseases. New York: Springer and Arthritis Foundation.
Ruddy,
Shaun, et al., eds. 2001. Kelley’s
textbook of Rheumatologi, 6th ed. Philadelphia: Saunders.
0 komentar:
Post a Comment